RESUMO
As vias de reparo ao dano de DNA (RDD) são essenciais para a manutenção da integridade genômica. Mutações em genes que atuam nessas vias podem contribuir para o desenvolvimento de câncer. BRCA1 é um gene extremamente polimórfico, codificando uma proteína envolvida em importantes eventos de sinalização nuclear em resposta ao dano de DNA. Portadores de mutações em BRCA1 que levam a uma proteína disfuncional podem ter o risco aumentado de desenvolvimento de câncer de mama e ovário em até 80%. Alterações em BRCA1, tais como inserções, deleções e mutações nonsense, podem ser inferidas como patogênicas, uma vez que a perda dos últimos 11 resíduos de aminoácidos na região C-terminal resulta em uma proteína não funcional. Mutações do tipo missense, assim como inserções e deleções que mantém o quadro de leitura, apresentam dificuldades na classificação. Estudos funcionais representam uma importante ferramenta para a classificação da patogenicidade dos variantes com baixa frequência na população (ou ainda não identificados). Em 2007, nosso grupo estabeleceu um ensaio funcional que correlaciona a atividade transcricional de BRCA1 e a integridade da região C-terminal da proteína (ensaio de TA) essa região (aminoácidos 1396 a 1863) é capaz de recrutar a holoenzima RNA polimerase II. Assim, é possível correlacionar a atividade de um sistema repórter com a patogenicidade de uma mutação específica. Este estudo tem foco na região de ligação entre os domínios tBRCT, denominada linker (aminoácidos 1737 a 1759). Foram preditas todas as mutações naturais missense no linker (132 variantes) e, utilizando estratégias de bioinformática (Align-GVGD, SFIT e PolyPhen), foram estabelecidas os níveis de associação ao câncer. Variantes previamente estudados/classificados em outros trabalhos (16) não foram incluídos, resultando em um conjunto de 116 variantes. Somente 23 variantes foram preditos como associados ao câncer por todos algoritmos. Os variantes selecionados para o estudo foram gerados e clonados no vetor pCDNA3, codificando uma proteína de fusão (domínio de ligação ao DNA de GAL4 fusionado a BRCA1 C-terminal). As construções foram utilizadas para obtenção de dados funcionais através do ensaio de TA. Os experimentos foram originalmente conduzidos a 37oC. A maioria dos variantes (20) apresentou um perfil patogênico, enquanto 3 varinate, todos na posição 1740, apresentaram perfil semelhante aos controles não patogênicos. Esses variantes demonstraram uma variação significativa na atividade transcricional (tanto entre replicatas, quanto experimentos independentes), sugerindo um comportamento termossensível. Assim, todos os variantes foram testados a 30ºC. Os variantes na posição V1740 mantiveram um comportamento não patogênico, no entanto 9 variantes apresentaram aumento estatisticamente significativo na atividade transcricional. Não foram observadas alterações significativas na estrutura secundária do linker como consequência de substituições de aminoácidos quando analisados através do diagrama de Ramachandran. As diferenças observadas a 37ºC e 30ºC sugerem que o linker é, possivelmente, um segmento termossensível na estrutura de BRCA1. Todos os dados gerados serão avaliados em modelo matemático (VarCall) para determinar a patogenicidade dos variantes de BRCA1 abordados nesse estudo.